突破 | 血管类器官太难？已成功应用于发育和疾病研究！

      尽管关于心血管疾病的研究取得了巨大进步，但其仍然威胁着全球人类的健康，造成全世界三分之一的死亡。物种特异性通路和缺乏高通量方法，往往限制了新疗法的研究。复杂的三维血管环境、错综复杂的细胞串扰和器官特异性结构，又进一步复杂化了对人体体外模型的探索。

      大脑、肠道和肾脏等多种组织的新型类器官模型的开发，标志着个性化医疗和疾病研究领域的飞跃。利用胚胎或患者来源的干细胞，可在受控的体外环境中模拟和研究不同的发育和病理机制。最近开发的自组织人类毛细血管类器官（blood vessel organoid，BVO），概括了血管生成、血管生成和糖尿病血管病变的关键过程。该类器官系统已被用作其他疾病过程的模型，经过改进和适应器官特异性。

   加拿大英属哥伦比亚大学的Josef M. Penninger教授团队在《Circulation Research》上发表题为“Blood Vessel Organoids for Development and Disease” 的综述文章，讨论了血管工程的新方法和替代方法，探索工程血管与体内血管系统相比的细胞特性，并展望血管类器官的未来前景和治疗潜力。

一、BVOs的实现难度

      人体血管系统是复杂的，负责维持组织的氧气和营养供应、清除废物或穿梭免疫细胞，先于大多数其他器官的发育。广义上讲，成熟血管可以可分为毛细血管系统、静脉系统和动脉系统。这些类别的血管在结构和细胞组成方面具有明显差异，同一类型细胞之间在转录和功能水平上存在异质性。例如，内皮细胞（endothelial cells，ECs）形成所有血管的最内层，它们具有作为组织环境功能的特定特征，由于功能多种多样，不同组织之间的ECs具有巨大的差异。

      尽管血管由ECs组装而成，但血管直径的结构完整性和修饰由壁细胞控制，即周细胞和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）。ECs和壁细胞之间的功能串扰对于适当的血管稳态很重要，许多血管疾病是壁细胞功能障碍的直接结果。除了ECs外，还需注意血管周围细胞的类型和结构。

      在过去十年中，为实现这一目标进行了许多尝试。对（部分）血管系统进行建模的最简单方法是将人类血管细胞培养为单层，并检查由遗传扰动或暴露于感兴趣的化合物引起的表型或分子变化。人脐静脉ECs是血管研究中常用的，ECs能够通过改变它们的结构来感知和适应流动方向。现有的分化方法对于研究单个血管细胞类型非常有用，优势在于可以基于患者来源的细胞，从而忠实地代表复杂的疾病基因型。

但它们缺乏在体内观察到的三维环境和组织组装。因此，很难在二维环境中研究内皮尖端细胞向细胞外基质的规范和侵入、壁细胞的共分化和募集，或血管对不同流动参数的反应。也有利用支架或利用血管细胞自组织形成血管的更复杂模型，但它们无法完全捕捉所有发育阶段，因此会错过潜在的重要中间细胞类型。

近年来，类器官领域得到了极大扩展。在血管系统的背景下，复杂三维模型有两个关注点。其一，对于发育和疾病，模拟和观察人体血管细胞与其环境相互作用的能力是必不可少的。在血管生成过程中，细胞外基质被降解以允许ECs迁移和浸润到周围组织中。用促血管生成因子刺激ECs会导致负责胶原蛋白、明胶和纤连蛋白降解的基质金属蛋白酶上调。此外，血管系统由不同的生理和环境参数决定并对其做出反应。因此，类器官模型可以（部分）替代不道德或过于资源密集而无法对活体动物进行的研究，例如缺氧的影响或流动参数的修改。

其二，大多数类器官培养方案的一个主要缺点是静态培养条件。当类器官超过一定大小时，由于营养物和氧气被动扩散的物理限制，核心中会发生广泛的细胞死亡。规避这一限制的一种方法是在微流控芯片中培养类器官。营养物质的可控流动不仅可以延长类器官的寿命，还可以促进类器官的生长。尽管有商业版本，但大多数类器官芯片都是专门为感兴趣的组织设计的，可扩展性仍然很差。因此，将功能性、可灌注的脉管系统集成到其他组织的类器官中的前景已成为一个关键话题。类器官的血管化已被证明对靶组织的成熟有积极贡献，体外类器官的预血管化提高了体内移植后的植入率。

二、BVOs研究发育和疾病

Josef M. Penninger教授团队于2019年开发了首个真正意义上的人类 BVOs。该方案从中胚层祖细胞的共同池中分化出多种血管细胞类型，以及这些血管细胞在生长过程中的内在自组织。干细胞最初聚集成胚状体，随后通过Wnt刺激和BMP-4进入中胚层谱系。通过补充VEGF-A和毛喉素（forskolin），可将mural和ECs与常见的中胚层祖细胞区分开来。血管诱导后，类器官仍然类似于粗略的细胞聚集体，直径在100到200微米之间。

为了诱导血管，将它们嵌入由I型胶原蛋白/Matrigel混合物组成的双层外细胞基质（extracellular matrix，ECM）替代品中。嵌入几个小时后，可以看到第一个细胞渗入ECMs。成功释放Matrigel后，类器官通常维持约3至4周。成熟的类器官由内皮细胞、周细胞、间充质干细胞样细胞和极小比例的造血细胞组成。

使用这些血管类器官来模拟糖尿病血管病变的过程。对2型糖尿病患者真皮血管系统的分析表明，基底膜增厚且呈多层。因此，在体外暴露于升高水平的葡萄糖、TNF和 IL-6的血管类器官表型复制了在患者脉管系统中观察到的扩张的基底膜。用γ-分泌酶抑制剂DAPT消除了基底膜增厚并恢复了ECs的增殖。最后，多个γ分泌酶靶标的药理学抑制和基因消融将DLL4和NOTCH3确定为糖尿病血管病变的关键介质和潜在的新靶点。

在最近的预印本中，血管类器官被用来说明ECs中糖酵解的重要性以及对代谢变化对脉管系统的影响。ECs中的糖酵解主要受酶PFKFB3、基因消融以及小鼠药理学靶向改变的血管萌发和血管形成调控。在类器官中对PFKFB3进行药理学抑制后，观察到ECs增殖显著减少，而周细胞不受影响。此外，该研究表明ECs中糖酵解抑制后发生了强烈的血管重塑。该研究表明，血管类器官确实可以用于研究代谢对脉管系统的影响，并且新陈代谢的扰动对人体血管有显著影响。

由此可见，血管类器官有可能用于疾病研究，因为它们显示出通常仅限于体内血管系统的表型改变。尽管在创建疾病模型方面付出了巨大努力，但单个细胞类型的发育进程及其结构背景（静脉与动脉 ECs）仍然未知。在另一篇预印本中，研究人员通过对不同发育阶段的BVOs进行全面的单细胞转录组学分析解决了这个问题。

毛细管类器官的一个缺点是无法在体外产生更大的血管。脱离培养阶段，血管无法在体外增加复杂性并形成小动脉或小静脉样结构。因此，类器官也不具有中膜或外膜，混淆了这些部分动脉粥样硬化过程的体外研究。目前的类器官培养物无法模拟VSMC的过度增殖、巨噬细胞浸润或斑块形成。这种限制可以通过将类器官移植到免疫缺陷NOD/SCID γ小鼠的肾囊中来规避。在那里，类器官存活长达6个月，与宿主脉管系统吻合，并变得完全可灌注。虽然许多一般血管生成途径在物种之间是保守的，但蛋白质同种型和表达模式存在细微差异。希望未来的研究能够提出无需动物宿主即可开发更大血管的方法，从而极大地促进动静脉特异性疾病的高通量研究。

在体外，BVOs的灌注仍然是一个挑战，需要移植到动物宿主中进行适当的血管化和灌注，既增加了成本和时间，也重新引入了潜在的物种特异性效应。为了解决缺乏可控灌注的问题，目前科研人员正在研究一种用于血管类器官的微流体方法，下一步将研究压力变化如何影响血管重塑、ECs特性或壁细胞组成。

当前的BVOs需要使用Matrigel，但其成分存在差异。为解决这个问题，有研究团队新提出一种不使用Matrigel的BVOs方案。他们在96孔板中使用锥形琼脂糖涂层来聚集诱导性多能干细胞和随后的类器官培养，并用CHIR99021和BMP4进行为期3天的治疗以诱导中胚层。通过单剂量100 ng/mL VEGF处理48 h后诱导血管，之后类器官永久维持在N2B27培养基中。这种替代培养方案直接影响类器官的形态。但该研究表明，在不使用高度可变的基质和长期受促血管生成因子影响的情况下，可以在类器官中实现三维血管结构，利用细胞在给定正确组织背景下的内在自组织能力。未来的进展应该在这两种方法之间找到折中方案，例如，通过具有特定刚度的全合成水凝胶密切模仿感兴趣的器官环境。

三、组织型血管系统和特定功能

除了转录差异外，不同器官的血管系统通常高度适应于执行特定功能和细胞组织。这方面的一个例子是ECs和EC渗透性在不同器官中的排列。脑ECs通透性受限，因为它们的紧密连接有助于血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）。在肾脏中，可以发现一个开窗的内皮，允许更大的分子通过，并且对肾小球滤过很重要。在肝脏、脾脏和骨髓中发现与多孔基底膜相关的不连续内皮层。特殊的细胞类型也可以与血管结合并调节其功能，例如大脑中的星形胶质细胞或骨髓中的造血干细胞。接下来，将讨论开发器官型血管类器官，并将其特征与体内对应物进行比较。

1. 大脑血管

脑血管系统高度专业化，其中星形胶质细胞与血管紧密结合，并与紧密的内皮接头结合形成血脑屏障。小胶质细胞作为专门的免疫细胞，有助于神经发生并调节损伤下的恢复。因此，这些脑特异性细胞可导致脑血管病。

2013年，Lancaster等人发布了第一个脑类器官方案，此后在结构和复杂性方面取得了重大进展。脑类器官的一个关键方面是引入脉管系统来模拟血脑屏障，并提供更好的营养支持，从而促进较大类器官的生长和成熟。一项针对血脑屏障三维模型的研究利用了血脑屏障的自组织能力脑血管细胞，在悬滴培养板中同时接种原代脑ECs、原代周细胞和原代星形胶质细胞。所有3种细胞类型自发地自组装成具有独特细胞组织的球体。将这些球体与细胞混合物的不同排列进行比较发现，ECs是调节其他细胞类型增殖的重要组成部分。三细胞球体在一定时间后停止了细胞生长，而周细胞-星形胶质细胞球体则不受阻碍地生长，直到形成坏死核。通过流式细胞术分析，说明三维环境的重要性和周细胞增强稳定EC相互作用的能力。然而，作者无法证明血脑屏障的功能特征，例如选择性化合物摄取或紧密连接的存在。

尽管具有星形胶质细胞和小胶质细胞的BVOs可能是一个很好的模型，但由于培养条件的限制，这尚未实现。在最近发表的一项研究中，Sun等人相反使用血管类器官和脑类器官的共培养来获得血脑屏障样特征。通过Wnt信号向中胚层胚状体的初始分化，随后使用BMP4、bFGF进行血管诱导，然后嵌入基质胶中获得血管类器官。在2个血管祖细胞类器官之间神经上皮胚状体共包埋后，这些梭形细胞被在神经血管成熟培养基中进一步培养。延长培养会获得几个血脑屏障特征。这种共培养方法将在未来几年发挥非常重要的作用，作为主要的类器官血管化策略和体外构建复杂器官的初始构建块。

2. 骨髓血管系统

骨髓是成年人造血干细胞的主要来源。Giger等人使用基于微孔的方法，将ECs和间充质干细胞共同接种以形成球状体。通过对间充质干细胞与ECs的比率进行多次滴定实验，发现双细胞型类器官中自我更新的间充质干细胞数量较多。ECs自组织成网络，在出现衰退迹象之前保持稳定约1周。来自这些球状体的间充质干细胞可以分化成脂肪细胞、软骨细胞和前成骨细胞。在形成3天的类器官上接种造血干细胞后，细胞归巢并迁移到类器官内部，模拟了体内数据，即注射到受辐照的小鼠宿主中的造血干细胞将归巢并重建骨髓。

在另一种方法中，诱导多能干细胞最初聚集并诱导为中胚层聚集体。通过添加BMP4、FGF2、VEGF-A、SCF和Flt3，类器官被包埋在胶原蛋白/Matrigel混合物的水凝胶中。这些类器官显示出分化为腔化血管以及造血干细胞与血管的结合，类似于骨髓。单细胞测序分析证实了几种造血细胞和基质细胞亚型的存在。重要的是，轨迹分析表明，分化的细胞起源于体内也存在的骨髓分化的主要途径。此外，这种类器官系统可用于模拟疾病期间发生的病理性骨髓纤维化，例如急性白血病。或者将此类类器官移植到例如 MISTRG小鼠，这些小鼠与传统的免疫缺陷小鼠相比，支持更多免疫细胞的发育。再或者，这些骨髓类器官可以暴露在微流体装置中的受控流动中，从而测试是否可以实现造血细胞的循环。未来的研究应侧重于将循环血细胞纳入体外血管系统。总的来说，在从人类干细胞创建血管化骨髓壁龛方面取得了很大进展，在疾病建模、体外造血祖细胞生成，甚至控制导致造血缺陷的突变的基因修复方面具有巨大潜力。

3. 淋巴管

淋巴管代表微血管系统的一种特殊亚型。由于淋巴管在免疫学、组织引流和疾病过程中的重要参与，人们已经付出了很多努力来理解淋巴管背后的基本生物学。淋巴管生成过程特别受关注，因为淋巴管在肿瘤转移中起关键作用，而且癌细胞已显示分泌促淋巴管生成因子。目前还没有能够忠实地概括淋巴血管生成和淋巴管生成的体外模型，这种模型的一个主要障碍是淋巴ECs的起源。在胚胎发育过程中，淋巴EC源自Prox1+/Lyve1+静脉ECs群。静脉血管的要求引起一个问题，即目前可用的 BVO 方案是否可以进行修改以完成体外淋巴血管生成。在BVO模型中，人们可以在培养第21天时检测到静脉EC标记，但血管具有毛细血管性质，因此可能不具备所需的Prox1+/Lyve1+种群。最近的一项方案描述了来源于多能干细胞的人动脉和静脉特异性ECs，测试这些静脉内皮细胞是否具有产生淋巴内皮细胞的能力，以及这种方法是否可以与三维分化方案相结合，将会很有趣。

四、通过遗传驱动的器官型

研究人员想讨论的一种器官型血管类器官，是基于特定基因的过表达来驱动特定细胞类型的发育。在一项研究中，科研人员过表达了NEUROD1以实现神经血管，也过表达了 MYOD1B+AF60C来创建肌血管类器官。NEUROD1诱导了第15天BVOs中的MAP2+神经元，但它们在类器官内形成大簇而不是均匀分布。对于肌血管类器官，观察到类似的情况，因为 MYH+细胞聚集在区域中。研究表明，在长时间培养后，神经元标记物 MAP2、VGLUT2、BRN2和 FOXG1上调，而不会丢失 CDH5或 SMA表达。神经血管类器官的进一步表征显示神经元自发放电，证明了功能性神经元组织。将神经血管类器官皮下植入免疫缺陷小鼠证明类器官是可灌注的。而在胚胎骨骼肌肌球蛋白3上调的芯片上，肌血管类器官受到慢性电刺激。

因此，谱系特异性驱动基因的表达可以作为一种将实质组织和可能的器官特异性引入血管类器官的方法，而不是完全依靠外在的生长因子。这种方法的一个主要挑战是，并非所有组织都知道这种谱系特定的遗传驱动因素。可能需要替代方法，例如敲低或定时调节某些基因来设计复杂的感兴趣的血管化组织。

五、总结

血管疾病是影响数亿人的全球健康负担之一，干细胞和组织工程的最新突破允许在受控培养条件下创建EC、周细胞和真正的血管类器官。这些人类血管类器官和工程化血管细胞类型可用于研究疾病过程、正常发育或筛选药物的治疗效果。

本综述讨论了在没有Matrigel的情况下，血管形成的能力和器官型血管系统的方案。然而，为了充分探索这些类器官的潜力，需要解决几个问题：Matrigel的利用、替代品和中高通量筛选的标准化、受控灌注、转录动态特性或缺乏毛细血管以外的血管复杂性。目前，已有团队表明这些问题是可以解决的。当前需要将这些进步和努力转化为人类医学，以测试此种类器官是否可用于未来的再生医学。