2023年4月12日,康奈尔大学Matt DeLisa 教授团队与乔治亚理工学院 Ankur Singh教授团队共同通讯,在 ACS Central Science 上发表了题为 “Profiling Germinal Center-like B Cell Responses to Conjugate Vaccines Using Synthetic Immune Organoids” 的文章。该项工作初步展示了免疫类器官平台具有加速缀合物疫苗研发的潜力。
这项工作得到了比尔和梅琳达盖茨基金会(Bill and Melinda Gates Foundation)、美国国防威胁降低局 (the Defense Threat Reduction Agency)、美国国立卫生研究院、Wellcome Leap HOPE 计划和美国国家科学基金会的支持。
摘 要
该研究开发了一种含有初始B细胞的合成类器官,合成了用于治疗土拉菌(又称“兔热”)的糖缀合物疫苗,选取两种候选蛋白载体的(糖)缀合物疫苗(CRM197是已知强免疫原,MBP是已知较弱免疫原),研究糖缀合物是否能够在免疫类器官中形成生发中心(Germinal Center, GC),并刺激初始B细胞增殖、分化形成浆细胞产生特异性抗体。
研究表明,B细胞在免疫类器官模型与免疫小鼠模型中的响应相似,均能增强GC标志物表达、BCR成簇、细胞内信号传导和体细胞超突变等。同时,免疫类器官模型也展示了初始B细胞增殖、分化为浆细胞过程中的生化指标的变化。因此,此模型不仅能够用于筛选糖缀合物疫苗,还能对不同类型疫苗引起的特异性免疫反应和产生抗体进行机理研究。此外,相较于数周数月的免疫小鼠模型,免疫类器官模型能在更短的时间内(4天)完成初步疫苗测试转化。这些研究结果均凸显出免疫合成类器官的潜力,能够快速预测疫苗的有效性,并加快抗原特异性抗体的开发。
1.糖缀合物诱导抗原特异性抗体生成
小鼠体内给药三次,相对于不带多糖的缀合物,糖缀合物CRM197-FtO-PS能够生成更多的FtLPS- IgG特异性抗体,同时CRM197-FtO-PS的免疫原性显著优于MBP-FtO-PS,原因可能是前者的多糖更长或者前者的蛋白载体的免疫原性更强(图1b)。而对于载体蛋白诱导生产的特异性抗体MBP- IgG/ CRM197 -lgG特异性抗体,相对于PBS,均生成了3 lg以上的特异性抗体,此时扩展的多糖结构不会影响特异性抗体的生成(图1c)。
图 1 糖缀合物在体内不同程度地诱导抗原特异性抗体生成
2.糖缀合物在类器官上展现出增强型GC效应
从野生型小鼠的脾脏中分离初始B细胞,并将其与基质40LB细胞在含有细胞黏附肽” REDV”的水凝胶中混合,滴加入96孔板后加入交联剂固化培养,形成高通量类器官筛选平台。其中,基质40LB细胞来源于基因工程小鼠的3T3成纤维细胞,能够表达T细胞信号的CD40L和B细胞激活因子(BAFF)的滤泡树突状细胞信号(图2a)。
4天后,酶解水凝胶,发现80%的B细胞成GC表型(CD19+ GL7+);B细胞活化表型特征-CD86表达显著上调,且相较于MBP载体蛋白,CRM197诱导的CD86表达量更高,说明CRM197更有助于B细胞的成熟;最后,CRM197-FtO-PS诱导的中心细胞表型CXCR4loCD86hi (亮区,增殖缓慢的B细胞)/中心母细胞表型CXCR4hi CD86lo (暗区,增殖迅速的B细胞)的表达值明显高于MBP-FtO-PS或CRM197载体蛋白,说明CRM197-FtO-PS诱导的B细胞更早离开生发中心,结束增殖;进而B细胞进入分化阶段,CRM197-FtO-PS诱导的CD138+浆母细胞显著高于MBP-FtO-PS或载体蛋白,且CRM197,再次验证了MBP的低免疫原性(图2b-2e)。
图2 糖缀合物在合成类器官中形成的GC类B细胞亚群
3.糖缀合物诱导的GC样B细胞BCR成簇和信号转导
B细胞一旦与抗原结合,BCR信号通路和B细胞表面的纳米结构均将调控B细胞的活化。糖缀合物CRM197-FtO-PS诱导的lgM表达值显著相对于载体蛋白CRM197,且从空间上看,每个B细胞上的BCR簇同样多于载体蛋白CRM197,表明糖缀合物能够增强BCR的表达与成簇(图3a-3b)。分析BCR信号转导通路的关键激酶BTK(布鲁顿氏酪氨酸激酶)和B细胞成熟下游的核转录因子NF-kB(核因子激活的B细胞的κ-轻链增强),结果表明CRM197-FtO-PS和CRM197诱导的BTK和NF-Kb显著高于MBP197-FtO-PS和MBP,同蛋白载体的缀合物中,糖缀合物的表达量高于蛋白载体本身,结果表明缀合物的蛋白载体和拓展的多糖结构均影响着BTK和NF-Kb的活化。接下来,分析GC效应相关因子的表达,均证实以CRM197为载体蛋白的缀合物中,FtO-PS多糖结构显著促进GC活化(图3d)。
图 3 糖缀合物在合成类器官上诱导的BCR成簇和信号转导
4.免疫类器官发现高亲和力的单克隆抗体
在初步证实GC类器官能够保持GC样B细胞的一些核心结构特征和功能,特别是体细胞高频突变刺激生成多样化的免疫球蛋白后,团队进一步研究是否可以利用载体蛋白或糖缀合物刺激的免疫类器官,得到对CRM197或FtO-PS具有高亲和力和特异性的单克隆抗体(图4a)。筛选上清液中的96种抗原特异性结合物,得到对CRM197和FtO-PS具有亲和力和特异性的单克隆抗体分别有46和62个。从中各挑选出3种最强的抗原特异性结合物进行定量ELISA实验,6种克隆均展现出对各自抗原的高亲和力(图4b)。进一步分析类器官来源的克隆体与各自种系的序列同源性,发现VH和VL序列保持了63-95%的相似性(图4c),此外,每个克隆都含有10个以上的种系突变。这些同源性和种系突变研究展示了从种系到亲和力成熟的抗体结构的免疫学演变。
图 4 免疫类器官促进抗原特异性单克隆抗体的发现
总的来说,疫苗研制是一个漫长的过程。利用动物模型评估疫苗的安全性及其预防疾病的潜力是不可缺少的一个环节,其免疫反应周期大约需要两个月。而在本研究中,通过类器官模型,可以实现对候选疫苗的更高通量的筛选和评估,并且能在更短的时间内完成初步测试,加快疫苗研发的进度。
原文链接:https://doi.org/10.1021/acscentsci.2c01473