OSC 2024 类器官标准化大会
第三届粤港澳类器官与器官芯片医工融合发展大会
Organoid Standardization Convention
创新转化·标准先行
2024.4.20-21 中国·深圳

重磅文献 | Emulate 心脏芯片揭示VPTKIs药物心脏毒性风险

很高兴与大家分享一篇新年刚刚见刊于微流控芯片领域知名期刊【Lab on a Chip】的论文,该论文首基于Emulate器官芯片技术在体外重建心脏芯片,发现在生物力学刺激下,心脏芯片的功能成熟度和基因表达成熟度均得到提升,并且验证了在药物诱导下的典型心脏毒性表型,为促进药物开发和个性化医疗应用提供新思考。

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主要亮点

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传统实验模型难以模拟心脏生理结构和功能,无法准确评估药物引发的心脏毒性


  • 对药物心脏毒性进行临床前评估的传统方法为动物模型,但这些动物模型价格昂贵、通量低,而且在生理上表现出物种特异性差异,很难再现成人心脏中心肌细胞(CMs)、血管内皮细胞(ECs)和支持细胞(如成纤维细胞)的典型结构和功能,因此难以准确评估药物反应。而传统细胞模型则由于均培养在静态体系,培养基无法流动,更为重要的是,难以模拟心脏跳动,因此传统细胞模型与人体真实心脏生理环境相差甚远。因此,迫切需要开发具有成本效益、高度可扩展性并能预测心脏毒性的替代方法。

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Emulate器官芯片技术重现心脏生理结构和功能,有效预测药物诱发的心脏毒性


  • 本研究中,Cedars-Sinai医学中心的Arun Sharma教授团队们基于Emulate器官芯片技术,开发了心脏器官芯片模型,在液体持续流动和机械拉伸力作用下,其人体生理仿真度更高,可从机理上研究心脏毒性。Emulate器官芯片系统可以模拟多细胞相互作用、组织-组织界面、心脏收缩产生的机械力、血管灌注产生的剪切应力以及生理微环境本项目开发的心脏芯片有助于测试化疗药物(如血管内皮生长因子受体2/表皮生长因子受体抑制酪氨酸激酶抑制剂(VPTKIs)的心脏毒性。Emulate心脏芯片中专有的生物力学刺激能提高 hiPSC-EC 和 hiPSC-CM 的功能和遗传成熟度,模拟内皮屏障通透性,表现出与生理相关的跨内皮细胞电阻(TEER),准确预测了药物渗透性,并展示长期功能稳定性我们展示了Emulate心脏器官芯片作为评估 VPTKI 心脏毒性的预测平台的实用性。


背景简介


血管内皮生长因子受体(VEGFR2)和血小板衍生生长因子受体(PDGFR)酪氨酸激酶对内皮细胞和心肌细胞的存活和功能至关重要,且这些受体通路在癌细胞中高量表达,因此,将这些受体酪氨酸激酶受体拮抗剂(VPTKIs)作为化疗药物治疗癌症有着极大价值,目前全球正有 20 多种 VPTKIs 管线处于开发阶段。然而,VPTKIs 受限于其诱发的心脏毒性,包括心律失常、心肌细胞凋亡、心力衰竭、内皮细胞功能障碍和血管毒性、急性血栓和高血压事件等,其药物开发受到了极大限制VPTKIs药物波纳替尼和索拉非尼因曾顺利通过动物实验评估而推进到临床试验,但在临床试验中,这两种药物表现出对人的肝脏毒性及各种心肌和血管功能障碍相关的临床毒性,因此也受到美国FDA的黑框警告如果能在临床前,更早的预测和评估VPTKIs药物心脏毒性,将极大降低药物开发成本,帮助筛选处更具前景的候选药物。

Emulate器官芯片技术利用微流体结构的优势,实现了不同细胞类型的三维共培养。微流体元件提供了一个共享的 "系统循环",细胞培养基和营养物质可在集成芯片上的多种细胞类型之间流动。器官芯片系统可以模拟多细胞相互作用、组织-组织界面、心脏收缩产生的机械力、血管灌注产生的剪切应力以及生理微环境。我们使用Emulate 公司的 Chip-S1器官芯片,它包括两个由多孔膜隔开的不依赖流体的通道,可以模拟体内情况进行细胞-细胞相互作用和扩散。每个通道中的细胞都可以生长在细胞外基质上,可保持静态培养状态,也可以连接到提供连续流细胞培养基和/或有节奏机械拉伸的系统上。还可将小分子化合物、药物和其他环境刺激引入芯片的任一通道,通过纵向培养基取样进行药物筛选。该芯片表现出与生理相关的跨内皮细胞电阻(TEER),准确预测了药物渗透性,并增强了细胞成熟度。

本研究中,科学家们通过向芯片中接种 hiPSC 衍生的 EC 和 CM 来研究 VPTKI药物的心脏毒性。研究表明,Emulate器官芯片平台可通过介质流动和有节奏的生物力学拉伸产生的剪切应力增强 hiPSC-EC/CM 成熟,并模拟 VPTKI 治疗,从而成为预测人类药物毒性的 "心脏芯片"。我们展示了Emulate心脏器官芯片作为评估 VPTKI 心脏毒性的预测平台的实用性。这项研究可能有助于开发评估和预防癌症治疗引起的心脏毒性的新方法


01: 利用源自 hiPSC 的功能性血管内皮细胞和心肌细胞可生成多谱系心脏芯片


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图1:利用 hiPSCs 诱导分化成心肌细胞和血管内皮细胞

了初步生成多谱系"心脏芯片",从Cedars-Sinai iPSC核心实验室获得的健康对照hiPSC系分化出了人类血管内皮细胞和心肌细胞。生产 hiPSC 衍生的心肌细胞需要使用小分子CHIR99021(一种 GSK3-beta 信号抑制剂)和Wnt-C59(一种 Wnt 信号抑制剂)来调节 Wnt 信号通路(图 1A)。在外源性胰岛素的进一步促进下,hiPSC-CMs在分化后第 7 天左右能够自发收缩(下方视频),并且 hiPSC-CMs 表达心肌肌节的标准标记物,包括心肌钙蛋白T(cTnT)和α-肌动蛋白(α-act)(图 1B)。同样,利用 CHIR99021 调节 Wnt 信号,结合生长因子和 TGF-beta 信号抑制剂 SB431542,生成了源于 hiPSC 的血管内皮细胞,以防止成纤维细胞增殖(图 1C)。30 利用磁珠分选纯化了表达 VE-cadherin(CD144)的血管内皮细胞,这些细胞还在细胞边界表达内皮标志物 PECAM-1(CD31)(图 1D)。


视频S1:心肌细胞自主收缩图

制备出 hiPSC-CMs 和 hiPSC-ECs 后,分两步将细胞接种到Emulate器官芯片中(图 2A)。纯化的 hiPSC-CMs 被接种在顶部通道,两天后,hiPSC-ECs 被接种在底部通道。在播种一周内,hiPSC-CMs 和 hiPSC-ECs 都在各自的通道中扩散并达到汇合(图 2B)。播种 1 周后,hiPSC-EC 和 hiPSC-CM 仍留在各自的微流控通道中,并显示出细胞特异性蛋白表达(图 2C)。心脏芯片上的细胞被一层多孔膜隔开,从而实现了心脏芯片通道之间的细胞串联和介质交换(图 2D)。芯片上的细胞能在多周的培养过程中保持活力和代谢稳定性(图 2E)。播种在心脏芯片上的 hiPSC-ECs 建立的细胞屏障完整性与之前公布的 ECs 相关数值相当,并通过葡聚糖渗透性检测证明了膜的通透性(图 2F)35。心脏芯片上收缩的心肌细胞的钙成像分析显示了标准的心肌细胞钙循环(图 S1)。总之,这些结果证明了由多种 hiPSC 衍生细胞类型组成的心脏芯片的完整性。

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图2:用 hiPSC-ECs 和 hiPSC-CMs 制作 "心脏芯片"

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图S1:心脏芯片上 hiPSC-CMs 的钙成像分析


02: 生物力学刺激进一步提升心脏芯片的功能和成熟度


我们接下来研究了生物力学刺激是否能进一步提高心脏芯片的效用。含有 hiPSC-CMs 和 hiPSC-ECs 的心脏芯片同时受到 0.4 Hz 有节奏的机械变形,每隔一定时间芯片尺寸缩小 10%,两个通道每小时有 30 μL 活性流体流动。α-肌动蛋白-GFP细胞在肌节上显示出GFP表达,并表现出更好的肌节排列,这是hiPSC-CM成熟度提高的标志(图3B)。在生物力学刺激(拉伸和流动)下对心脏芯片上的 hiPSC-CMs 进行的进一步功能分析,着重评估了 hiPSC-CMs 的长期收缩能力,与静态培养的下降搏动率相比,hiPSC-CMs 在数周内保持了每分钟 60 次左右的生理相关搏动率(图 3C)。在生物力学刺激下,对心脏芯片上的 hiPSC-CMs 跳动速度和振幅进行 10 天的量化显示,与在静态(未受刺激)条件下生长的 hiPSC-CMs 相比,其收缩速度和强度都有所提高(图 3D)。接下来,我们评估了仅在流动和流动+拉伸条件下 CM 的钙瞬时传播同步性,以了解周期性拉伸对 CM 成熟度和功能的具体影响(图 3E)。两种条件(流动与刺激)下的钙循环效率差异不显著(图 3F 左侧和中间)。然而,视野内三个独立 ROI 的钙信号频率在仅流动条件下的标准偏差(变异性)高于流动和拉伸条件(图 3F 右)。钙信号频率的变异性较高表明,与流动和拉伸相比,仅流动条件下 CM 之间的信号同步性较低。此外,还评估了在生物力学刺激下在心脏芯片上生长 10 天的 hiPSC-EC。这些 hiPSC-ECs 显示了管状网络的形成,可能是对活跃流体流动产生的剪切应力的反应(图 3G 和 H)。仔细观察活动流体流动和拉伸下的 hiPSC-ECs 发现,hiPSC-ECs 在液体流动方向的排列有所改善(图 3G 右侧、H 和 I)。

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图3:对心脏芯片进行主动生物力学刺激可提高 hiPSC-CM 和 hiPSC-EC 的功能成熟度。


除了机械刺激下心脏芯片中 hiPSC-CMs 和 hiPSC-ECs 的功能成熟外,我们还试图研究这些细胞类型的转录成熟度。在对静态与拉伸/流动条件下每个通道的大量样本进行 RNA 序列分析后,我们首先发现每种条件都有其独特的转录特征(图 4A)。此外,与静态条件相比,与 hiPSC-CM 成熟相关的肉瘤基因(如 MYH7)在生物力学刺激(主动拉伸和流动)下上调(图 4B)。值得注意的是,我们观察到 MYH7 的上调和 MYH6 的相应下调,它们分别与 hiPSC-CM 的成熟和不成熟有关。同样,与静态条件相比,心脏芯片内的 hiPSC-EC 在 10 天的主动拉伸和流动条件下,与 hiPSC-EC 成熟相关的基因也上调了(图 4C)。这些基因包括血管内皮细胞功能的典型标志物,如 CDH5、PECAM1 和 KDR。综上所述,这些结果表明,流体流动导致的主动生物力学拉伸和剪切应力同时提高了 hiPSC-CM 和 hiPSC-EC 的功能和转录成熟度。刺激培养与静态培养中 hiPSC-EC 的丰富基因本体(GO)术语证实了血管内皮生长因子信号通路基因和间隙连接基因的上调(图 4D 左)。同样,在刺激与静态条件下,hiPSC-CMs 中上调的富集 GO 术语列表中,与扩张型心肌病和离子通道功能相关的术语排在首位,推测上调了心脏标记基因和肉瘤蛋白(图 4D 右)。

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图4:对心脏芯片进行主动生物力学刺激可提高 hiPSC-CM 和 hiPSC-EC 的基因表达成熟度。

03: 利用心脏芯片验证VPTKIs药物的心脏毒性

心脏芯片的一个主要下游应用是检查与表现出内皮和心肌双重毒性的化疗化合物相关的心脏毒性,例如 VEGFR/PDGFR 受体酪氨酸激酶抑制剂 (VPTKI),这种抑制剂可同时引起患者高血压和不良心肌表型。为了同时检测药物对内皮细胞和心肌细胞的毒性,我们让心脏芯片在活跃的生物力学拉伸和流动条件下接受索拉非尼的处理,索拉非尼是一种 VPTKI,已知其临床毒性与心肌和血管功能障碍有关。为了检查这些潜在的组织和细胞类型特异性毒性,我们将心脏芯片置于生理学相关浓度的索拉非尼中。我们使用乳酸脱氢酶(LDH)检测法检查了 hiPSC-EC 和 hiPSC-CM 的细胞毒性,同时对 hiPSC-CM 的收缩曲线和钙瞬态动态进行了时间依赖性和剂量依赖性分析,并对两种细胞系进行了形态学分析。与心肌细胞相比,内皮细胞更明显的剂量特异性毒性趋势(图 5A),这可能是由于 hiPSC-ECs 中血管内皮生长因子受体的表达更高有关。此外,心肌收缩蛋白,即心肌肌钙蛋白 T 和 α-肌动蛋白的免疫染色反映了临床相关剂量的索拉非尼处理四天后心脏芯片中 hiPSC-CM 的毒性(图 5B)。用索拉非尼处理 4 天后,与未处理的细胞相比,hiPSC-EC 和 hiPSC-CM 都表现出更高的细胞毒性。有趣的是,与 hiPSC-CM 相比,hiPSC-EC 对索拉非尼的细胞毒性呈上升趋势(图 5C)。在心脏芯片上对索拉非尼处理过的 hiPSC-CMs 进行的收缩力分析表明,在暴露后第四天,索拉非尼浓度低至 1 μM 时,收缩幅度显著下降(图 5D 和 E)。同样,观察药物处理过的 CM 的钙瞬态曲线,8.34 μM 索拉非尼的高毒性效应早在药物暴露后的第二天就很明显,由于受损细胞对钙动态的不规则处理,细胞内动作电位传导被中断(图 5F 和 G 及 S3†)。这些结果表明,心脏芯片可用于药物毒性筛选,并可揭示潜在的细胞类型特异性毒性对心脏毒性化合物的反应。

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图5: VPTKIs药物在心脏芯片中可观察到细胞类型特异性的心脏毒性



小结:

心脏芯片平台可以在生理相关模型中筛选多种心血管细胞类型的潜在心脏毒性化疗药物。我们利用了器官芯片技术的最新发展,该技术利用微流体结构实现了不同类型细胞的三维共培养。细胞培养基和营养物质可在集成芯片上的多种细胞类型之间流动。器官芯片系统可以模拟多细胞相互作用、组织-组织界面、心脏收缩产生的机械力、血管灌注产生的剪切应力以及理化微环境。我们所展示的数据表明,Emulate器官芯片上的主动流动/拉伸可促进 hiPSC 衍生心肌细胞和 hiPSC 衍生血管内皮细胞的功能和转录成熟。该模型可更好地估算药物毒性和更准确地再现心脏生物学,Emulate器官芯片系统提供了一种独特的方法来解决上述问题。最终,基于 hiPSC 的Emulate器官芯片系统(如本文介绍的心脏芯片)可减少对动物模型的依赖,并且在预测心脏毒性上表现出强劲的性能。

Reference:Mozneb, Maedeh et al. “Multi-lineage heart-chip models drug cardiotoxicity and enhances maturation of human stem cell-derived cardiovascular cells.” Lab on a chip vol. 24,4 869-881. 13 Feb. 2024, doi:10.1039/d3lc00745f